Загрязнение кормов для животных микотоксинами, активное использование антибактериальных средств в животноводстве, повышение требований к пищевой ценности и подлинности молока, определяет необходимость выбора оптимальных методов аналитического контроля качества и безопасности молока, учитывая при этом доступность и воспроизводимость методик, оперативность получения результатов, экономические и иные факторы.
Низкий уровень предельно-допустимой концентрации афлатоксина М1 (не более 0,0005 мг/л, в продуктах детского питания - не допускается), запрет присутствия антибиотиков в пищевых продуктах [1], необходимость маркировки количества витаминов в продуктах детского питания требует организации высоко-квалифицированных лабораторий на предприятиях молочной промышленности. Для проведения анализа физико-химическими методами, как правило нужна многостадийная очистка субстратов, которая занимает много времени, приводит к потерям анализируемого вещества и увеличению ошибки анализа. Наиболее распространенный метод контроля этих веществ - высокоэффективная жидкостная хроматография (далее ВЭЖХ) предполагает наличие дорогостоящего оборудования и использование реактивов высокой степени очистки, что существенно сказывается на конечной стоимости анализа.
В последнее десятилетие наблюдается быстрое внедрение иммунохимических методов анализа (преимущественно, иммуноферментного метода, далее - ИФА) в лабораторную практику, связанное с усовершенствованием техники такого анализа и обусловленное потребностью в быстрых, чувствительных, специфичных, производительных и простых методах.
Метод ИФА (или ELISA) был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США [2].
Отличительными особенностями метода является высокая чувствительность, специфичность, высокая производительность, экспрессность, возможность использования минимально очищенных экстрактов, сравнительно низкая стоимость оборудования.
Метод основан на специфическом воздействии антигена (загрязняющего вещества) и антитела (полученного против контролируемого вещества). Образующийся комплекс антиген-антитело после его мечения ферментом детектируется по цветной реакции с помощью простых измерительных приборов.
Для контроля молока, как в зарубежной практике, так и в России уже широко используется иммуноферментный анализ. Для подтверждения результатов анализа применяется метод иммуноаффинной очистки с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Огромное значение для его дальнейшего распространения имеет серийное производство высококачественных компонентов для иммуноферментного анализа - антител и коньюгатов, а также комплектных тест-систем для ИФА, выпускающихся под контролем системы качества ISO9000
Большой спектр тест-систем представлен серией RIDASCREEN FAST, RIDASCREEN и RIDA (Таблица 1), с помощью которых исследование молока по показателям качества и безопасности может быть выполнено за короткое время [3], причем возможно как количественное определение, так и полуколичественный анализ при визуальном учете результатов.
Таблица 1. Некоторые серийно выпускающиеся тест-системы и иммуноаффинные колонки для анализа молока
| Наименование тест-системы | Предел обнаружения | Время пробоподготовки /анализа |
| Определение афлатоксина М1 | ||
| Иммуноаффинные колонки AFLAPREP M | Определяется ВЭЖХ | 40 мин |
| Иммуноаффинные колонки RIDA Aflatoxin | Определяется ВЭЖХ | 40 мин |
| RIDASCREEN® Афлатоксин М1, 96 опр. | < 0.00001 мкг/кг (молоко) < 0.0001 мкг/кг (сыр) |
0.5 (молоко); 2 (сыр) / 3 часа |
| RIDASCREEN® FAST Афлатоксин М1, 48 опр. | 0.00025 мкг/кг | 5 мин / 15 мин |
| Определение антибиотиков и других антибактериальных препаратов | ||
| RIDASCREEN® Левомицетин, 96 опр. | 0,0125 мкг/кг | 10 мин/3 часа |
| RIDASCREEN® Тетрациклин, 96 опр. | 1,5 мкг/л | 30 мин/1,5 часа |
| RIDASCREEN® Стрептомицин, 96 опр. | 20 мкг/л | 1 час / 3 часа |
| RIDASCREEN® Сульфамезин, 96 опр. | 10 мкг/л | 30 мин/3 часа |
| RIDASCREEN® FAST Сульфамезин, 48 опр. | 10 мкг/л | 20 мин/ 20 мин |
| RIDASCREEN® Нитрофураны, 96 опр. | 0,1 мкг/л | 2+16+ 2 ч/1.5 ч |
| RIDASCREEN® Фторхинолоны, 96 опр. | 1 мкг/л | 1 час 15 мин |
| Определение витаминов | ||
| RIDASCREEN® FAST Витамин В12, 48 опр. | 0,5 мкг/л | 30 мин/30 мин |
| Иммуноаффинная колонка EASI-EXTRACT Витамин В12 | Пробоподготовка перед ВЭЖХ | 20 мин |
| RIDASCREEN® FAST Фолиевая кислота, 48 опр. | 10 мкг/л | 30 мин/30 мин |
| RIDASCREEN® Биотин, 96 опр. | 0,3 мкг/л | 3 часа/ 1.5 часа |
| Тест-системы серии Vita® FAST для определения тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пантотеновой кислоты (В5), пиридоксина (В6), биотина (В7), фолиевой кислоты (В9), цианкобаламина (В12), инозитола, холина | Превышает требования СанПиН по пищевой ценности продуктов питания | 48 часов |
| Определение энтеротоксинов стафилококка | ||
| 0,2 мкг/л | 1 час/2.5 часа | |
| Определение подлинности | ||
| RIDASCREEN® Казеин, 48 опр. | 0,5% коровьего казеина | 2 часа/2,5 часа |
| RIDASCREEN® CIS, 48 опр. | 0,1% коровьего молока в козьем или овечьем молоке (сыре) | 10 мин/1.5 часа |
| RIDA® Quick CIS, 25 опр. | 0,5 % коровьего молока в козьем или овечьем молоке (сыре) | 10 мин |
| RIDASCREEN® GIS, 48 опр. | 0,1% козьего молока в овечьем молоке (сыре) | 10 мин/1.5 часа |
| Определение аллергического потенциала | ||
| RIDASCREEN® Бета-лактоглобулин, 96 опр. | 5 мг/л | 30 мин/3 часа |
Очень многие тест-системы RIDASCREEN FAST и RIDASCREEN уже включены в официальные методы Минздрава России, Управления ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству РФ и Российской академии сельскохозяйственных наук.
Так, например, разработаны "Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина М1 в молоке, сухом молоке и сыре с помощью тест-системы "RIDASCREEN AFLATOXIN M1" МР №17/ФЦ3739, "Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина М1 в молоке и сухом молоке с помощью тест-системы "RIDASCREEN FAST AFLATOXIN M1" 17ФЦ/3735, "Определение остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа" МУК 4.1.1912-04, "Методические указания по количественному определению антибактериальных препаратов в продовольственном сырье и продуктах питания животного происхождения методом конкурентного иммуноферментного анализа" МУК 5-1-14/1005
Для определения афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах международная организация по стандартизации и международная молочная федерация также рекомендуют метод конкурентного иммуноферментного анализа, соответственно, ISO 14675: 2003 и IDF 186:2003
Кроме того, подготовлен стандартный метод ISO 14501:1998, использующийся для исследования молока и сухого молока на афлатоксин М1 с помощью метода иммуноафинной очистки (колонки AFLAPREP M, RIDA Aflatoxin), с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией со спектрофлуориметрической детекцией
Известно много вариантов постановки ИФА. Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируется на твёрдой фазе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель
Для наглядности рассмотрим вариант гетерогенного конкурентного ИФА, реализованный в тест-системе RIDASCREEN FAST Афлатоксин М1
На рисунке 1 схематично показана лунка полистиролового планшета, в которой последовательно выполняются все стадии иммуноферментного анализа
Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован "антителами захвата", наработанными к антителам к афлатоксину М1 (антигену)
Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые или стандартные
растворы, препарат, содержащий антитела к афлатоксину М1 и препарат, содержащий коньюгат афлатоксина М1 с ферментом, дозируются в лунки планшета (см. Рисунок 2). При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксина М1 и молекулы коньюгата, конкурируя между собой, связываются антителами в объеме раствора. В то же самое время, при инкубации происходит иммуносорбция антител к определяемому антигену "антителами захвата" на поверхности лунок планшета (см. Рисунок 3).
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы коньюгата (см. Рисунок 4).
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в 
качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции (см. Рисунок 5).
После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на
желтый (см. Рисунок 6)
Интенсивность окраски в лунках ИФА-планшета обратно пропорциональна концентрации афлатоксина М1, другими словами - чем насыщенней цвет растворов, тем меньше концентрация афлатоксина М1 в молоке (см. Рисунок 7)
Обработка результатов измерений может выполняться вручную, либо с помощью специализированного программного обеспечения, например, RIDA Soft.
- Для выполнения исследований молока с помощью большинства тест-систем необходимы следующие материалы и оборудование:
- ИФА-фотометр, снабженный фильтром на 450 нм
- Одноканальные автоматические пипетки на 50 мкл и на 200 - 1000 мкл
- 8-канальные автоматические пипетки на 50 мкл и 250 мкл (рекомендуется)
- Наконечники для автоматических пипеток
- Стеклянная посуда
- Центрифуга
- Пробирки с притертыми стеклянными или винтовыми пробками
Рисунок 7. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN FAST Афлатоксин М1
- В заключение подчеркнем основные преимущества иммуноферментного метода анализа
- сравнительно с другими методами:
- Экспрессность и высокая производительность;
- Простота пробоподготовки и анализа, удобство работы;
- Высокая чувствительность и специфичность метода;
- Гибкость метода - анализ может быть проведен по выбору вручную или автоматически;
- Низкая стоимость требующегося оборудования и расходных материалов, небольшие затраты на постановку и поддержку метода;
- Освоение метода не требует специальных знаний.
- Литература
- СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. - М.: Минздрав России, 2002.
- Иммунологические методы (под редакцией Г.Фримеля).1987г.; Стр.162, 163-170.
- Галкин А. Теория и практика иммуноферментного анализа. - Био. - Июнь - 2003, с. 33.