На протяжении последних 10 лет во ВНИИМС ведутся постоянные исследования молока сырого, производимого в хозяйствах Угличского района Ярославской области, а также в ряде хозяйств других областей Центрального и Северо- Западного регионов РФ, по всему комплексу показателей, значимых для выпуска безопасных, качественных и хранимоспособных молочных продуктов.
Во всем мире, в том числе в нашей стране, проблема маститов стоит на одном из первых мест, определяющих безопасность и санитарно-гигиенические показатели молока.
Содержание соматических клеток – важнейший косвенный показатель здоровья вымени, так как при воспалительном процессе в молоке резко увеличивается количество клеток крови, в частности лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, которые могут поглощать клетки патогенных микроорганизмов – возбудителей мастита и в молочной железе играют защитную функцию.
Наряду с клетками крови к соматическим относятся любые клетки организма, кроме половых. Клетки вымени (эпителиальные) попадают в молоко естественным путем из молоковыводящих каналов в ходе старения и обновления эпителия и являются постоянной составной частью молока. В молоке здоровой коровы их содержание составляет 60–70 % от общего количества соматических клеток и не влияет на качество и безопасность. Нормальное фоновое содержание соматических клеток в молоке колеблется в зависимости от возраста, периода лактации, породы и индивидуальных особенностей животного от 100 до 500 тыс. соматических клеток в 1 см3 нормального молока. Наличие в молоке из отдельной доли вымени менее 500 тыс. в 1 см3 соматических клеток при отсутствии патогенных бактерий свидетельствует о нормальной секреции, при наличии патогенов – о скрытой инфекции вымени. В международной практике установлена верхняя граница допустимого содержания соматических клеток в молоке из одной четверти вымени 5⋅105 клеток. Для сборного молока границу устанавливают обычно ниже – от 3⋅105 до 5⋅105 клеток в 1 см3.
В соответствии с Федеральным законом от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» и Федеральным законом от 22 июля 2010 г. № 163-ФЗ «О внесении изменений в Федеральный закон “Технический регламент на молоко и молочную продукцию”» содержание соматических клеток в молоке высшего сорта не должно превышать 4⋅105 клеток в 1 см3, а в молоке первого и второго сортов – 1⋅106 клеток в 1 см3. По данному показателю сыропригодным может быть только молоко высшего сорта. В техническом регламенте Таможенного союза допусти- мая норма содержания в молоке сыром соматических клеток – 7,5⋅105 в 1 см3, при этом для молока сырого, предназначенного для производства детского питания, сыров и стерилизованного молока, – не более 5⋅105 клеток в 1 см3.
Очень важно, что содержание соматических клеток в молоке можно легко и быстро определить. Для выявления в заготовляемом сырье примеси маститного молока используются прямые и косвенные методы, основанные на установлении количества соматических клеток. К косвенным методам определения количества соматических клеток в молоке относятся методы их выявления при взаимодействии с рядом реагентов. В настоящее время определение количества соматических клеток в молоке регламентируется ГОСТ Р 54077-2010 «Молоко. Методы определения количества соматических клеток по изменению вязкости» и проводится с использованием диагностических препаратов типа «Мастоприм» визуальным способом и с применением вискозиметра. Стандарт разработан ГНУ «ВНИИМС Россельхозакадемии» и используется при приемке молока на всех молокоперерабатывающих предприятиях РФ.
Метод основан на воздействии сульфанола – поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм», – на клеточную оболочку соматических клеток, что приводит к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция), что фиксируется визуально или вискозиметром. Для анализа используются пластинки ПМК-1 с последующей визуальной оценкой или вискозиметры капиллярного типа, откалиброванные производителем прибора на определение количества соматических клеток в сыром молоке.
Визуальная оценка крайне проста и надежна, так как не зависит от «капризов» прибора, однако не дает возможности получить конкретные цифровые показатели количества соматических клеток в молоке. При визуальной оценке мы можем определить только границы безопасности:
- менее 5⋅105 клеток в 1 см3 молока принято считать физиологической нормой (не более 6 % примеси маститного молока в сборном);
- более 5⋅105, но менее 1⋅106 клеток в 1 см3 молока говорит о значительной примеси маститного молока (до 30 %);
- более 1⋅106 клеток в 1 см3 молока свидетельствует о маститном молоке, которое приемке не подлежит.
Большинство предприятий в настоящее время имеет возможность применять вискозиметры тех или иных производителей для контроля соматических клеток в молоке. При этом они имеют конкретные цифровые показатели в диапазоне от 9⋅104 до 1,5⋅106 клеток в 1 см3 молока.
Однако наши исследования показывают, что на значения вискозиметров большое влияние оказывает фальсификация молока сырого как химическими веществами, так и путем воздействия температурой: - добавление в молоко перекиси водорода, мочевины, соды и других веществ, используемых для фальсификации тех или иных показателей молока-сырья, приводит к прямо пропорциональному снижению значений вискозиметра в зависимости от их концентрации;
- любое нагревание молока до температур термизации или пастеризации приводит к сбою показаний прибора, и вискозиметр показывает значения менее 90 тыс. клеток в 1 см3 молока независимо от их истинного содержания.
Эти особенности необходимо учитывать при анализе получаемых результатов. Опыт работы многих предприятий свидетельствует о том, что при контроле соматических клеток в молоке с использованием вискозиметра в журналах фиксируются значения менее 90 тыс. в 1 см3, которые специалисты, принимающие молоко на предприятии, считают нормой и относят данное молоко к высшему сорту. Такие выводы являются очень опасным заблуждением, так как в норме для сборного молока показатель соматических клеток менее 200 тыс. в 1 см3 у стада на территории РФ не наблюдается. Чтобы получить такой уровень соматических клеток в сборном молоке, необходимо иметь стадо перводоек в первые 3–4 мес после лактации.
Показания вискозиметра менее 90 тыс. в 1 см3 говорят о фальсификации молока или об иных отклонениях от нормы.
Существует косвенный метод определения соматических клеток в молоке сыром, основанный на принципе флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval. В настоящее время данный метод не включен ни в один национальный стандарт, поэтому на основании законодательства РФ может использоваться только для проведения внутрипроизводственного контроля, а результаты анализов не могут быть использованы в случае арбитражных споров. Однако данный метод широко используется молочными хозяйствами в странах как Европы, так и Таможенного союза.
В отделе микробиологии ВНИИМС в результате многолетней работы в рамках темы Россельхозакадемии «Создать систему контроля молока-сырья и разработать исходные требования к молоку-сырью для сыроделия» накоплен значительный экспериментальный материал по сравнительной оценке всех существующих методов определения соматических клеток. Это позволило, проведя статистический анализ результатов определения соматических клеток в молоке сыром разными методами, дать предложение о включении метода флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DeLaval DCC наряду с методами контроля по изменению вязкости в программу международной стандартизации.
Сущность метода заключается в том, что цитоплазматическая мембрана соматических клеток разрушается под действием лизогенного буфера, после чего ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя, в качестве которого используется пропидий йодид (PropidiumIodide – PI). Пропидий йодид связывается с двухспиральной ДНК соматических клеток, и образуется флуоресцентное вещество, поглощающее зеленый свет и излучающее красный, идентифицирующее клетки. Таким образом, система дает изображение клеток, а встроенный в анализатор компьютер с помощью программного обеспечения подсчитывает количество белых точек, что соответствует количеству соматических клеток.
Nucleo-кассета – одноразовое приспособление, состоящее из проточной системы, поршня и измерительной камеры, где непосредственно происходит анализ. Флуоресцентный краситель пропидий йодид зафиксирован в первых трех каналах проточной системы Nucleo-кассеты.
При заполнении Nucleo-кассеты образцом молока оно смешивается с флуоресцентным красителем PI и клеточные ДНК окрашиваются. После размещения Nucleo-кассеты в приборе окрашенная смесь автоматически попадает в измерительную камеру. После анализа образец и PI остаются внутри Nucleo-кассеты, которую можно безопасно утилизировать. Это обеспечивает безопасное проведение анализа. Кроме того, использование Nucleo-кассет исключает необходимость очистки прибора и его технического обслуживания.
В рамках данной работы проведены исследования влияния различных факторов на результаты определения количества соматических клеток, получаемые методом, основанным на принципе флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval: - прослеживается пропорциональное снижение средних показателей количества соматических клеток в зависимости от температуры: чем выше температура обработки молока, тем ниже показатели. Следовательно, метод флуоресцентной микроскопии применим только для подсчета соматических клеток в сыром молоке, не прошедшем термическую обработку;
- независимо от вида фальсифицирующего агента в пределах испытанных концентраций перекиси водорода и мочевины влияния химических агентов на показатели счетчика соматических клеток DCC не наблюдается;
- повышение бактериальной обсемененности сырого молока не оказывает значимого влияния на результаты подсчета количества соматических клеток. Не установлено значимого влияния спор споровых анаэробов на показатели счетчика соматических клеток DCC.
Сравнительная оценка результатов контроля количества соматических клеток в молоке параллельно тремя косвенными методами представлена в табл. 1.
Как видно из табл. 1, доля проб молока, соответствующих требованиям безопасности, при анализе одной и той же выборки зависит от метода определения количества соматических клеток и его чувствительности. Сравнительная статистическая оценка методов определения количества соматических клеток в сыром молоке проведена с использованием непараметрического критерия знаков Z и критерия Уилкоксона Т.
С вероятностью 95 % можно утверждать следующее: - определение количества соматических клеток как визуальным методом оценки вязкости, так и вискозиметрическим дает сопоставимые результаты;
- при использовании для статистического анализа критерия знаков Z метод флуоресцентной микроскопии дает показатели, превышающие соответствующие значения, полученные вискозиметрическим методом. Однако при проведении статистической оценки с использованием рангового критерия Уилкоксона Т (данный критерий рассчитывается аналогично критерию знаков Z, но является более «мощным», чем критерий знаков) установлено, что при заданном уровне значимости невозможно отбросить нулевую гипотезу и, следовательно, данный критерий не выявляет статистически значимых различий в определении количества соматических клеток с помощью вискозиметра и счетчика соматических клеток.
С учетом полученных данных в проект межгосударственного стандарта были включены три перечисленных косвенных метода контроля соматических клеток в молоке.
Всероссийским научно-исследовательским институтом сертификации на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта создан ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)», идентичный международному стандарту ИСО 13366-1:2008 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)» [ISO 13366-1:2008 « M i l k – E nu m e r at i o n o f s o m at i ccel l s – Pa r t 1 : Microscopicmethod (Referencemethod)»]. Данный стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.
Использование этого стандарта сопряжено с применением опасных материалов, требует специального оснащения приборами и оборудованием. На пользователя данного стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности, охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до использования.
Подготовка и профессиональное мастерство микробиолога являются основными решающими факторами успешного использования метода. Для обеспечения надлежащего уровня подсчета необходимы как теоретические знания, так и большие практические навыки. Метод крайне трудоемкий, а время проведения одного анализа составляет не менее 3–4 ч.
Результаты, полученные в рамках совместных международных исследований коровьего молока в 2005 г. при разработке стандарта ISO 13366-1:2008, в которых приняли участие 18 лабораторий из 13 стран, говорят о том, что данный метод может быть реализован только в условиях специализированных лабораторий. Подтверждением сказанного служат результаты анализа восьми проб молока в 18 контрольных лабораториях Европы. Данные испытаний показывают, что из 144 проб (по восемь проб в 18 лабораториях) пригодными для статистического анализа были признаны только 95, а 49 участников были исключены по причине резко отклоняющихся результатов.
Есть негативные примеры использования данного метода в молочной промышленности, в частности на предприятиях Украины, пытающихся достичь гармонизации с международными стандартами и проверяющих правильность работы вискозиметров, сравнивая их результаты с описанным методом микроскопического подсчета соматических клеток. В отделе микробиологии ВНИИМС была проведена большая работа по оценке метода прямого микроскопирования соматических клеток в молоке в соответствии с упомянутыми стандартами.
Всесторонняя оценка как самого метода, так и получаемых результатов при контроле одной и той же пробы молока разными операторами позволила нам сделать вывод о невозможности применения данного метода в условиях производственных лабораторий для контроля молока-сырья. Коротко данный метод можно охарактеризовать как крайне трудоемкий, опасный для здоровья, длительный и плохо воспроизводимый.
Однако метод прямого микроскопирования является единственным прямым методом контроля, позволяющим увидеть, идентифицировать и сосчитать соматические клетки в молоке.
Поэтому мы провели модификацию метода в целях его упрощения и снижения уровня опасности. Разработанный вариант метода прямого микроскопирования молока для подсчета соматических клеток может быть при необходимости использован как прямой контрольный метод в условиях производственных лабораторий и включен в проект межгосударственного стандарта. Данный метод мы не можем считать арбитражным, так как при его реализации основные риски связаны с субъективными факторами, в частности с квалификацией конкретного исполнителя.
В табл. 2 приведены результаты сравнительных исследований четырех образцов сырого молока на количество соматических клеток, определяемых с помощью прямого метода микроскопирования и косвенных методов: по изменению вязкости на вискозиметре «Соматос-МИНИ» (производитель – ООО ВПК «Сибагроприбор») и флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC (фирма DeLaval). Для оценки воспроизводимости результатов каждое определение было проведено дважды.
Приведенные в табл. 2 результаты показывают, что при очень низком уровне содержания в молоке соматических клеток в данной серии опытов разброс данных значителен, однако укладывается в допустимую ошибку повторяемости 12 %. С увеличением в пробах количества соматических клеток результаты измерений, получаемые различными методами, сближаются. При содержании в молоке соматических клеток порядка 106/см3 метод прямого микроскопирования дает более высокие значения, чем косвенные методы контроля.
Проводя сравнительную оценку методов определения количества соматических клеток, можно утверждать, что показатели, получаемые при оценке одних и тех же проб молока, зависят как от используемого метода, так и от уровня содержания соматических клеток в молоке. По результатам проведенной работы разработан проект стандарта на методы контроля соматических клеток в молоке сыром по изменению вязкости, флуоресцентной микроскопией и на модифицированный контрольный метод – прямой подсчет соматических клеток путем микроскопирования. Проект стандарта включен в программу международной стандартизации на 2013 г. Разработчик стандарта – ВНИИМС.