Г.М. Свириденко, д. т. н., М.Б. Захарова, к. т. н., ФГБНУ «ВНИИМС»;
Микробиологические процессы, начиная с сырья, являются ключевыми, определяющими качество молочной продукции. Анализируя молоко сырое как значимую точку риска, сле-
дует учитывать сложность и неоднозначность самого критерия «бактериальная обсемененность». С одной стороны, это общий суммарный уровень содержания микроорганизмов в молоке – показатель КМАФАнМ, с другой – разнообразный бактериальный пейзаж, т. е. видовой состав микрофлоры, определяющий безопасность и качество молочных продуктов .
Источник первичного обсеменения молочных продуктов микроорганизмами – молоко-сырье. Обсеменение молока сырого происходит на этапе его получения, хранения, транспортировки и зависит от здоровья животных, в том числе их вымени; санитарно-гигиенического состояния ферм (чистоты оборудования, воды, воздуха, личной гигиены персонала) и качества кормов.
Требования к молоку сырому по бактериальной обсемененности, установленные нормативными документами РФ, Таможенного союза и ЕЭС, представлены в табл. 1.
В цепи производственного контроля молочного сырья и готовой продукции микробиологические исследования – самый сложный элемент. Как правило, стандартные методы микробиологических исследований достаточно трудоемки и для получения результата требуется нескольких суток. В итоге результат продолжительного микробиологического исследования не может быть использован в производственном процессе и является формальным.
Для управления технологическими процессами в молочной промышленности необходимы количест венные экспресс-методы микробиологического конт роля, дающие результат в режиме реального времени и обеспечивающие возможность быстрой микробиологической диагностики поступающих потоков сырого молока разного качества.
Решение глобальной проблемы нехватки качественного сырого молока состоит не только в увеличении продуктивности молочного стада, но и в оптимизации существующей производственной инфраструктуры. Наличие быстрых методов оценки гигиены производства, в том числе сырья, позволяет локализовать риски для оперативной санации и значимо улучшить качество поставляемого молока.
Работа с поставщиками сырого молока – эффективный путь повышения безопасности всей производственной цепи. Поэтому она должна сводиться не к формальному декадному контролю, а к объективной оценке микробиологического качества молока в реальном вре мени и помощи поставщикам в устранении текущих проблем. Под реальным временем оценки микробиологического качества молока следует понимать диапазон в несколько минут. В этом случае быстрый количественный микробиологический результат становится ключом к инновационной системе управления современным производством, где цифровые данные немедленно поступают в информационную систему для оперативного принятия решения.
По этой причине быстрые количественные микробиологические методы находятся в зоне пристального внимания ведущих специалистов молочной индуст рии. До последнего времени о такой возможности переработчики молока могли только мечтать.
Согласно ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа», для определения бактериальной обсемененности молока сырого в качестве арбитражного метода используется стандартный чашечный метод посева определенных разведений исходного молока на твердую питательную среду КМАФАнМ с последующим культивированием в течение 72 ч при (30±1) °С и подсчетом колоний образующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)
Основной недостаток чашечного метода – длительность анализа, так как большинству микроорганизмов для образования видимых колоний необходимо не менее 2–3 сут.
Питательная среда, используемая для определения бактериальной обсемененности молока, должна обеспечивать рост единичных клеток, не ограничивая и не создавая условий для опережающего развития каких-либо отдельных групп микроорганизмов, а также обеспечивать должную выявляемость тех микроорганизмов, которые способны расти и размножаться в молоке и молочных продуктах. Большое значение для точности метода имеет размер колоний, образуемых на чашках и подлежащих подсчету. Чем больше диаметр колонии, тем выше вероятность того, что она будет визуально замечена и учтена при подсчете
Точность и воспроизводимость результатов определения бактериальной обсемененности молока чашечным методом зависит от ряда причин:
- ростовых характеристик питательной среды и правильности ее приготовления;
- точности работы микробиолога при приготовлении разведений продукта и проведении посева;
- правильности подсчета колоний и обработке результатов.
Для определения уровня бактериальной обсемененности молока сырого ГОСТ 32901-2014 предполагает возможность применения косвенного экспресс-метода – редуктазной пробы.
В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими окислительновосстановительными ферментами, анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.
Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По интенсивности изменения окраски резазурина через 1 ч оценивают уровень бактериальной обсеменности сырого молока.
Основные преимущества оценки уровня бактериальной обсемененности молока по редуктазной пробе:
- метод крайне прост в исполнении и не требует специального оборудования;
- метод малозатратный, не предполагающий дорогостоящих реактивов;
- метод, проверенный многолетним опытом применения в промышленности.
Основные недостатки метода:
- низкая чувствительность (порог чувствительности составляет 3⋅105 КОЕ/см3);
- дает возможность отнести молоко к тому или иному классу (до 500 тыс. в 1 см3 молока – I класс; более 500 тыс. в 1 см3 молока – II класс) без конкретных показателей количества бактериальных клеток.
В отделе микробиологии ВНИИМС на протяжении многих лет ведутся постоянные исследования не только микрофлоры молока и молочных продуктов, но и методов их контроля. Реально до последнего времени мы не располагали возможностью предложить промышленности приборный экспресс-метод определения бактериальной обсемененности молока, обеспечивающий надежную сходимость результатов с арбитражным методом оценки показателя КМАФАнМ, нормируемого Техническим регламентом Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и внесенного в ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа».
В 2013 г. в отделе микробиологии ВНИИМС были начаты испытания нового отечественного пробора, предназначенного для определения бактериальной обсемененности молока, – турбидофлуориметра «БиоТФ» (Государственный реестр СИ № 56270-14).
Турбидофлуориметрия – оптическая технология, ис-пользуемая для измерения крайне низких значений флю-оресценции в мутных растворах биологических жидкостей. Математическая и статистическая обработка динамических значений интенсивности флуоресценции на основе кинетики и стехиометрии микробного роста позволяют точно рассчитать общее количество микроорганизмов. Данный метод получил условное название «биокинетический анализ динамики флуоресценции в процессе метаболизма флуорогенного субстрата микро-организмами».
Флуоресцентная технология «БиоТФ» позволяет про-водить измерение непосредственно в образце молока, отказавшись от разведений и анализируя микроорганизмы во всем объеме представительной пробы.
Результаты определения могут быть представлены как в абсолютных значениях микробной биомассы, так и со-отнесены с результатами определения колониеобразую-щих единиц (КОЕ) или численностью клеток.
Принцип действия турбидофлуориметра «БиоТФ» основан на свойствах света рассеиваться и поглощаться поверхностью взвешенных в жидкости частиц и на опти-ческом явлении флуоресценции – свечении вещества при возбуждении светом фиксированного диапазона длин волн. Результаты измерения флуоресценции в мутных растворах
Для формирования протокола исследования используют программное обеспечение «БиоТФ», которое собирает и обрабатывает данные турбидофлуориметра в соответствии с методикой выполнения измерения «Старт», формализованной в виде программного приложения.
Перед началом исследования тест-пробирку «Старт», содержащую комплекс реагентов, и образец сырого молока необходимо нагреть до температуры 20 °С. Пробу сырого молока вносят в тест-пробирку «Старт» c помощью дозатора, тщательно перемешивают и помещают в измерительную камеру турбидофлуориметра «БиоТФ» (см. фото).
Измерение начнется и закончится автоматически. Программное обеспечение «БиоТФ» рассчитает общее количество микроорганизмов в 1 см3 молока. Общее время, необходимое для проведения анализа, – 7–10 мин. Диапазон определения: от 10 000 до 2 000 000 бактериальных клеток/см3 молока. Чувствительность метода – 1 бактериальная клетка [5].
Испытания турбидофлуориметра «БиоТФ» проводились на молоке, поступающем из хозяйств Угличского района в Испытательный центр «ТЕСТ-МС». За 1,5 года сравнительных исследований проанализировано 320 образцов сырого молока. Бактериальную обсемененность в образцах молока определяли параллельно четырьмя методами: арбитражным чашечным методом на среде КМАФАнМ; чашечным методом посева на питательную среду, соответствующую по составу стандартам ЕЭС; ре-
дуктазной пробой и приборным методом с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ».
Графическая зависимость для общего массива данных, полученных при определении бактериальной обсемененности молока арбитражным методом на среде КМАФАнМ и с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ», представлена на рис. 1
Основной критерий сходимости методов – коэффициент линейного уравнения (1,025), при этом свободный членлинейного уравнения (0,0281) несет информацию о сдвиге методов. Чем ближе коэффициент к единице и чем ближе свободный член к нулю, тем выше сходимость методов.
Для оценки возможности применения экспресс-метода при входном контроле было исследовано 137 образцов молока сырого по показателю бактериальной обсемененности.
Исследования проводили стандартным чашечным методом в соответствии с ГОСТ 32901-2014 и при-
борным экспресс методом «Старт» – «БиоТФ».
На рис. 2 и 3, а также в табл. 2 представлены результаты статистической оценки методов контроля бактериальной обсемененности образцов молока, ранжированных по классам:
•• I класс – до 100 тыс. КОЕ/см3 ;
•• II класс – от 100 до 500 тыс. КОЕ/см3;
•• III класс – более 500 тыс. КОЕ/см3 .
Среднее значение десятичного логарифма численности микроорганизмов в серии экспериментов стандартным и экспресс-методом составило 4,69 и 4,81 lg КОЕ/см3, соответственно. Деление результатов, полученных в каждой серии экспериментов, на классы в соответствии с существующей системой градации качества молока выявило тождественность методов.
Данные статистической обработки результатов, представленные в табл. 2, подтверждают ранее сделанные выводы о сходимости показателей бактериальной обсемененности молока по всему диапазону значений. В каждом классе средние арифметические значения бактериальной
обсемененности, выявленные сравниваемыми методами, совпадают между собой. Кроме того, значения медиан в каждом классе для каждого метода совпадают со средними арифметическими, что свидетельствует о нормальном распределении и правомочности сравнения данных.
Всесторонний анализ полученных результатов как пообщему массиву данных, так и по группам молока с различным уровнем бактериальной обсемененности позволяет сделать следующие выводы:
•• метод определения бактериальной обсемененности
молока с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ» в полной мере отвечает требованиям экспрессности, так как суммарное время анализа не превышает 10 мин;
•• метод прост в применении и не требует специальной подготовки персонала;
•• метод определяет биомассу клеток в исходной пробе молока, которую затем автоматически пересчитывает в показатель КОЕ. Метод напрямую не фиксирует количество жизнеспособных клеток, которые мы затем определяем показателем КОЕ, однако максимально объективно, в сравнении с другими косвенными методами, приближается к оценке именно этого показателя;
•• значения бактериальной обсемененности молока, получаемые с помощью приборного метода, статистически достоверно совпадают с показателями арбитражного чашечного метода контроля КМАФАнМ при обсемененно-сти молока выше 100 тыс. КОЕ/см3 и несколько завыше-ны при уровне обсемененности ниже 100 тыс. КОЕ/см3.
Таким образом, мы можем реально предложить промышленности приборный экспресс-метод определения бактериальной обсемененности молока с помощью турбидофлуориметра «БиоТФ», обеспечивающий надежную сходимость результатов с арбитражным чашечным ме-тодом оценки показателя КМАФАнМ. Прибор не имеет зарубежных аналогов, что касается его стоимости, то как сам прибор, так и расходные материалы абсолютно доступны любым производителям молочных продуктов.
Получите подробную консультацию по анализатору бактериальной обсемененности молока у специалистов компании Агролаб по телефону 8 (383) 280-42-38